Physiologisches Kolloquium am Physiologischen Institut der LMU München
München, 6. Dezember 1996
Heute möchte ich über ein Verfahren berichten, mit dem man die Durchlässigkeit der BHS mit Hilfe von fluoreszierenden Tracern und computergestützter Bildverarbeitung messen kann. Bevor ich aber auf dieses Verfahren näher eingehe, möchte ich einige Charakteristika der BHS in Erinnerung rufen.
(Dia: Schnitt durch Gefäß) © Betz und Goldstein
Die BHS beschreibt eine Barriere zwischen dem Blutplasma und dem Extrazellulärraum des Gehirns. Diese Barriere ist notwendig für die Funktionsfähigkeit des Gehirns, da sie Konzentrationsunterschiede für Ionen, Hormone und Aminosäuren, die als Neurotransmitter oder deren Vorläufer dienen, aufrecht erhält.
Die Existenz der BHS konnte erstmals Paul Ehrlich 1885 nachweisen, als er entdeckte, daß eine intravenöse Injektion von Farbstoff alle Organe mit Ausnahme des Gehirns anfärbte.
Reese und Karnovsky zeigten, daß das morphologische Korrelat der BHS das kontinuierliche Endothel der Blutgefäße ist. Dieses zeichnet sich durch eine hohe Anzahl von Mitochondrien, eine geringe Zahl pinocytotischer Vesikel, komplexe, feste Zwischenzellkontakten, den sogenannten 'tight junctions' und eine enzymatische Aktivität aus. Brightman, Reese und Karnovsky zeigten weiterhin, daß diese 'tight junctions' für die Marker Meerettichperoxidase und Mikroperoxidase sowohl vom Blut aus, als auch vom interstitiellen Raum des Gehirns aus, eine Schranke bilden. Die Astrocyten selbst stellen dagegen keine Barriere dar.
Fettlösliche Substanzen können die BHS durch einfache Diffussion überwinden, hingegen werden wasserlösliche Substanzen von der Lipidphase der Endothelmembran abgestoßen. Somit verhält sich das kontinuierliche Endothel mit 'tight junctions' wie ein dichtes Epithel, deren funktionelle Kennzeichen folgende sind:
(Dia: Charakteristika der BHS)
Zu diesen Transportmechanismen gehören die erleichterte Diffusion, bei der über substanzspezifische Carrier an der luminalen und abluminalen Endothelmembran Substanzen entlang ihres chemischen Gradienten die BHS permeieren können.
Ein weiterer Mechanismus, der primär aktive Transport, ist hier durch die Natrium-Kalium-ATPase an der abluminalen Endothelmembran repräsentiert. Die für diesen Transport benötigte Energie wird durch ATP-Spaltung bereitgestellt.
An den primär aktiven Transport gekoppelt sind mehrere sekundär aktive Transporte, wie hier z.B. der Natrium-Protonen-Antiporter an der luminalen Membran.
Schließlich existieren im Endothel abbauende Enzyme, die die Penetration von Transmittern und ihren Vorstufen einschränken oder verhindern.
Die durch die BHS aufrecht erhaltene Homöostase des Gehirns kann unter pathologischen Bedingungen wie Trauma, Ischämie, Tumore oder Entzündungen, die eine Öffnung der BHS zur Folge haben, gestört werden. Dabei erhöht sich der Einstrom zuvor reflektierter Substanzen und aus osmotischen Gründen folgt diesem Wasser nach. Somit entsteht ein vasogenes Hirnödem, bei dem Histamin, Bradykinin oder Arachidonsäure, im Hirngewebe gebildet und freigesetzt, als Mediatoren wirken können.
Diese Mediatoren induzieren eine Zunahme der Gefäßpermeabilität und häufig eine Vasodilatation und eine Erhöhung der Durchblutung, wodurch die Extravasation begünstigt wird. Ziel unserer Untersuchung war, mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie die Extravasation fluoreszierender Tracer und somit die Öffnung der BHS durch solche Mediatoren zu quantifizieren. Die Intensität und die Fläche der Extravasationen wurde dabei densitometrisch an Bildern der Hirnoberfläche bestimmt, nachdem der Gefäßbaum aus den Testbildern durch Subtraktion der Kontrollbilder eliminiert war.
Wir benutzten dazu folgenden Aufbau: Der cerebrale Cortex wurde in einem cranialen Fenster freigelegt. Die injezierten fluoreszierenden Tracer wurden von einer Hochdruckquecksilberlampe angeregt und die emittierte Fluoreszenzaktivität wurde von einer Kamera erfaßt. Die Aufnahmezeitpunkte wurden über das Beatmungsgerät auf das inspiratorische Plateau getriggert. Das Kamerasignal wurde verstärkt und auf einen Kontrollmonitor und einen Videorekorder gelenkt. Das aufgezeichnete Videosignal wurde zuvor mit einem eindeutigen Frame-Code versehen, damit es automatisiert im Anschluß an die Untersuchung computergestützt ausgewertet werden konnte.
Das Testobjekt lag auf einem in x- und y-Richtung computergesteuerten Tisch, so daß jede Position eindeutig angefahren und damit reproduziert werden konnte.
Das craniale Fenster wurde in 4 bis 6 Beobachtungsareale unterteilt und unter Paraffinöl gesetzt. Die Testsubstanzen wurden in künstlichem Liquor gelöst und in exponentiell steigenden Konzentrationen jeweils über eine halbe Stunde superfundiert.
Zunächst wurde ein Kontrollbild unter Applikation von künstlichem Liquor aufgenommen. Daraufhin wurden je Testsubstanzkonzenztration innerhalb der 30 Minuten 3 Aufnahmen, die sogenannten Testbilder, aufgezeichnet.
(Dias: Bild ohne und mit Extravasation)
Man erhielt folgende Aufnahmen: Zum einen ein Kontrollbild und zum anderen mehrere Testbilder, von denen das eine hier gezeigte keine, das andere dagegen deutliche Extravasationen aufweist. Diese Extravasationen sollten nun je Testbild quantifiziert werden, wobei das Ergebnis nicht durch Vasodilatationen oder Artefakte verfälscht werden sollte. Dazu sind einige Voraussetzungen für die Bildanalyse nötig.
(Dia: Requirements for Image analysis)
(Dia: Stabilität des Anregungslichtes)
Die Ausreißer von Experiment 2 beruhten auf einer defekten Lampe, die daraufhin ausgewechselt wurde.
(Dia: Linearität des Meßsystems)
(Dia: Shadingkorrekturverfahren)
Ein weiterer Punkt, der berücksichtigt werden muß, ist die ungleiche Helligkeitsverteilung - auch Shading genannt - die durch die Lampe verursacht wird. Diese äußert sich dadurch, daß die Randbereiche der Bilder deutlich
dunkler
sind, als der Bereich in der Mitte der Bilder. Dieses Phänomen wirkte sich ungünstig auf die nachfolgende Bildverarbeitung aus, und mußte daher durch eine Korrektur ausgeglichen werden. Dazu benötigt man ein Korrekturbild,
das ausschließlich
diese ungleiche Helligkeitsverteilung enthält. Zum einen haben wir dieses Korrekturbild aus einer Aufnahme eines mit Tracer gefüllten Eppendorfgefäßes bekommen, zum anderen haben wir es es aus dem Bild selbst berechnet.
Bei letzterem testeten wir zwei Möglichkeiten:
Zum einen formulierten wir eine zweidimensionale Funktion, einen Paraboloid, zum anderen berechneten wir eine Art Tiefpaßfilterung über das Bild.
(Dia: Shadingkorrektur mit Tiefpaß)
Bei der Tiefpaßfilterung, die wir letztendlich angewendet haben, wurde das Bild gleichmäßig in rechteckige Regionen unterteilt, deren Mittelwerte berechnet wurden. Aus diesen Mittelwerten wurden mehrere binäre Bilder generiert. Dabei wurde je Bild und damit Graustufe entschieden, ob der Mittelwert einen bestimmten Grauwert übersteigt, oder nicht. Diese binären Bilder wurden einzeln geglättet, zusammengesetzt, auf die ursprüngliche Bildgröße expandiert und noch einmal geglättet.
(Dia: Shadingkorrektur Vergleich)
Zur Bewertung der Güte der einzelnen Korrekturverfahren wurde eine Methode entwickelt, die die Helligkeitsunterschiede innerhalb eines Bildes mit einem korrekturspezifischem Wert bewertet. Dabei wurden die Standardabweichungen der in Regionen unterteilten korrigierten Bilder in Bezug zu den entsprechenden Werten der unkorrigierten Bilder gesetzt. Je höher dieser Wert ist, desto besser ist das Verfahren.
Unkorrigierte Bilder zeigen definitionsgemäß einen korrekturspezifischen Wert von Null. Die Methode, bei der mit einem mit Tracer gefüllten Eppendorfgefäß korrigiert wird, hier im Diagramm als 'in vitro'-Bild bezeichnet und in zwei Varianten dargestellt, zeigt zwar eine Korrekturwirkung, jedoch sind die Korrekturmethoden, bei denen das Korrekturbild aus dem Bild selbst berechnet wurden, dieser Methode überlegen. Die Methode, bei der über eine zweidimensionale Funktion ein Korrekturbild berechnet wurde, bringt zwar eine Verbesserung, wie hier wiederum an zwei Varianten zu sehen ist, jedoch die eben beschriebene Methode der Tiefpaßfilterung zeigt die deutlich beste Korrekturwirkung. Damit wurde diese Methode für die nun kommende Gesamtauswertung als Shadingkorrektur eingesetzt.
Das Grundschema der Auswertung einer Bildreihe sieht man auf diesem Dia. Zuerst wurde das Kontrollbild, auch Referenzbild genannt, eingelesen. Danach wurden die Testbilder eingelesen, von denen das Kontrollbild subtrahiert wurde. Alle Bilder wurden einer Bildvorverarbeitung unterzogen. Dazu zählen zuallererst rauschmindernde Verfahren, wie eine Mittelung über zehn aufeinanderfolgende Bilder der Videosequenz, eine Medianfilterung dieser Bilder, aber auch die Shadingkorrektur. Die Testbilder müssen zusätzlich einer Lagekorrektur unterzogen werden, damit das Kontrollbild von ihnen subtrahiert werden kann.
Nach der Subtraktion wurden die Ergebnisbilder nachbearbeitet, damit durch eine Grauwertmittelung ein sogenannter Ef-Wert als Maß für die Extravasation ermittelt werden konnte.
Im folgenden wird nur noch der rechte Teilbaum dargestellt. Das Verfahren wird dabei schrittweise durch Hinzufügen von Bildvorverarbeitungs- und Subtraktionsbildnachbearbeitungsschritten optimiert werden.
(Dias: Shading; Schema, Ergebnis)
Wir verglichen zunächst zwei Varianten der eben angesprochenen Shadingkorrektur mittels eines Tiefpasses. Dabei wurde bei der einen Variante ein Korrekturbild aus dem Referenzbild ermittelt, das dann konsequent auch bei allen folgenden
Testbildern der
zugehörigen Bildreihe zur Korrektur angewandt wurde. Bei der zweiten Variante wurde aus jedem Testbild ein eigenes Korrekturbild mit der Tiefpaßmethode ermittelt.
Diese Verfahren wurden der Extravasationsbeobachtung von 3 Experimentatoren in einem Gütevergleich gegenübergestellt. Bei der Extravasationsbeobachtung wurden 16 Testreihen mit insgesamt 263 Testbildern mit dem Auge in 4 Kategorien eingeteilt:
Mit Hilfe des computergesteuerten Auswerteprogramms wurde eine Kategorisierung der Extravasationswerte vorgenommen, deren Fehler gegenüber der Auswertung mit dem Auge möglichst klein war. Je kleiner der Fehler ist, der als
Fehlgüte bezeichnet
wurde, desto besser ist das Verfahren.
Wie man hier erkennen kann, entschieden wir uns im folgenden die Methode anzuwenden, bei der aus jedem Bild ein eigenes Korrekturbild ermittelt wird, da hier der Wert der Fehlgüte geringer, und damit besser ist.
(Dias: Helligkeitsangleich vor der Subtraktion; Schema, Ergebnis)
Durch geringfügige Schwankungen der Lampenintensität, der Tracerintensität oder durch Bewegungen des Objektes konnten Grundhelligkeitsschwankungen der Bilder beobachtet werden. Daher mußten die Bilder, die dunkler waren als
das Kontrollbild, durch einen Helligkeitsangleich an eine einheitliche Grundhelligkeit angepaßt werden, damit auch in diesen Bildern eine Aussage über Extravasationen möglich wurde. Hier wurden nun zwei Varianten eines
Helligkeitsangleichs
vor der Subtraktion durchgeführt. Dabei wurden die Bilder in 25 rechteckige Regionen unterteilt. Diese wurden gemittelt und die dunkelste Region wurde entweder additiv oder multiplikativ an die entsprechende Region des Kontrollbildes angeglichen.
Wie man auf dem Dia sieht, ist der multiplikative Helligkeitsangleich effektiver, als der additive, da hier der ermittelte Wert der Fehlgüte kleiner ist.
Eigentlich wäre jetzt der Vergleich der manuellen gegenüber einer automatischen Lagekorrektur angestanden. Dieser wird aber erst am Ende vorgenommen, damit die Werte der nachfolgenden Verfahren vergleichbar mit den Ergebnissen
bleiben, die bereits ermittelt wurden.
(Dias: Helligkeitsangleich nach der Subtraktion; Schema, Ergebnis)
Beim Helligkeitsangleich nach der Subtraktion wurden zunächst die Grauwerthistogramme der Subtraktionsbilder ermittelt. Von diesen Histogrammen wurden das Maximum, also der häufigste Grauwert, der Mittelwert, bzw. der Medianwert berechnet. Dieser, je nach Methode verwendete Wert wurde dann als Nullwert festgesetzt. Anschließend wurden dann beim Hochpaß alle Grauwerte, die kleiner als ein vorgegebener Wert waren gelöscht. Bei der Bandsperre wurden alle Grauwerte, um den Nullwert in einem vorgegebenen Bereich gelöscht. Dadurch wurde versucht, das Rauschen, das nach der Subtraktion vorhanden sein kann, zu minimieren. Es zeigte sich, daß durch den Helligkeitsangleich vor der Subtraktion kein weiterer Hellgkeitsangleich nötig wurde. Der Hochpaß brachte aber eine deutliche Verbesserung.
(Dias: Strukturelimination und Flächenelimination; Schema, Ergebnis)
Um das Verfahren noch weiter zu optimieren, versuchten wir, Strukturen zu erkennen und zu unterscheiden. Dabei war der Ansatz, daß Extravasationen eher eine runde Ausprägung, Dilatationen dagegen eine längliche, schlanke Ausprägung im Subtraktionsbild besitzen. Daher wurde bei dem Verfahren der Strukturelimination das Bild in den vier Hauptachsen, also horizontal, vertikal und den zwei Diagonalen, abgetastet und die Pixellängen zusammenhängender Strukturen, wurden gemessen. Alle Längen, die kürzer als ein vorgegebener Wert waren, wurden aus dem Bild gelöscht. Bei der Flächenelimination wurden alle zsammenhängenden Flächen, die kleiner als eine vorgegebene Pxelanzahl waren, gelöscht. Beide Methoden trugen zu einer Verbesserung des Verfahrens bei. In dem Diagramm sieht man, wie sich durch das schrittweise Hinzufügen der gerade vorgestellten Verfahren, jedesmal eine Verbesserung und damit Optimierung des Gesamtverfahrens erreichen ließ.
(Dias: Lagekorrektur; Schema, Ergebnis)
Zuletzt versuchten wir, wie bereits angekündigt, die manuelle Lagekorrektur durch eine automatische zu ersetzen. Es zeigte sich aber, daß die automatische Lagekorrektur mit den kontrastarmen Bildern vor allem dann Probleme hatte, wenn Extravasationen im Entstehen waren. Eine vernünftige Lagekorrektur konnte dabei nicht mehr beobachtet werden, so daß wir bei der manuellen Lagekorrektur geblieben sind.
Zur Verifikation des Verfahrens wurden verschiedene Situationen untersucht. Zuerst wurden Kontrollversuche bei Superfusion von künstlichem Liquor ausgewertet, also Zeitkontrollen mit intakter BHS. Dabei konnte keine signifikante Erhöhung der Ef- Werte festgestellt werden. Auch die Durchmesser und die Tracerkonzentration im Plasma zeigen keine signifikanten Änderungen. Die Methode liefert also bei Kontrollversuchen keine falsch positiven Werte.
Um zu untersuchen, ob eine Dilatation ohne Extravasation ein falsch positives Ergebnis liefert, wurde für ca. 10 Minuten eine moderate Hyperkapnie induziert. Dabei konnte kein Anstieg der Ef-Werte gemessen werden. Daher haben nicht nur die dilatierten Arterien der Oberfläche KEINEN Einfluß auf die ermittelten Ef-Werte, auch die Gefäße in den tieferen Schichten zeigen keine falsch positive Wirkung auf diese Werte. Bei den Venen ist, im Gegensatz zu den Arterien, keine systematische Änderung der Durchmesser zu beobachten.
(Dia: Nikotin Durchmesser Venen)
Durch eine Superfusion von Nikotin wurde eine Extravasation induziert, die nicht von einer Dilatation begleitet ist, wie aus den konstanten Werten der Gefäßdurchmesser zum einen hier bei den Venen zu sehen ist.
(Dia: Nikotin Durchmesser Arterien)
Auch bei den Arterien ist kein signifikanter Anstieg der Durchmesser zu beobachten.
Wie man aber hier sehen kann, registriert das Verfahren einen signifikanten Anstieg der Ef-Werte, wie wir es auch erwartet und beobachtet hatten.
Zuletzt wurde durch eine Superfusion von Adenosin eine Extravasation induziert, die auch von einer Dilatation der Gefäße begleitet ist. Wie man sehen kann, führt dies ebenfalls zu einem Anstieg der Ef-Werte. Wie wir vorhin gesehen haben, hat die Dilatation der Gefäße aber keinen Einfluß auf diese Ef-Werte, sondern nur die tatsächlichen Extravasationen werden mit ihren Intensitäten und ihren Flächen gemessen.
(Dias: Bild ohne und mit Extravasation)
Zum Abschluß möchte ich noch einmal auf die eingangs gezeigten Testbilder zurückkommen und Ihnen anhand dieser zeigen, welche Auswirkungen die vorgestellten Verfahren optisch auf die Bilder haben. In dem Bild ohne Extravasation sehen
sie hier eine vorübergehende Tracerablagerung an die Gefäßwand, die aber nicht auf eine durchlässige Gefäßwand schließen läßt.
Achten Sie auf die dunkleren Randbereiche, die durch die Shadingkorrektur mittels Tiefpaß auf eine homogene Grundhelligkeit über das gesamte Bild korrigiert werden.
(Dias: Korrekturbild ohne und mit Extravasation)
(Dias: korrigiertes Bild ohne und mit Extravasation)
(Dias: Subtraktionsbild ohne und mit Extravasation)
(Dias: Ergebnisbild ohne und mit Extravasation)
Mit diesem Verfahren ist es also möglich, quantitative und objektive Aussagen über Extravasationen zu machen, die durch reelle Zahlen, den Ef-Werten, repräsentiert sind. Vorher war es nur möglich, eine semiquantitative Klassifikation in vier Klassen vorzunehmen. Dieses Verfahren erlaubt es kontinuierliche Ef-Werte zu bestimmen, und damit Extravasationen an der BHS stufenlos zu quantifizieren.
